Pathologie: Technik und Methoden

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Inhaltsverzeichnis

1 Untersuchungsmaterial und Materialgewinnung
2 Materialtransport
3 Materialaufbereitung
4 Histochemie (Färbungen)
5 Immunhistochemie (IHC)
6 Elektronenmikroskopie (EM)
7 Immunfluoreszenz-Techniken (IF)
- 7.1 Direkte Immunfluoreszenz (DIF)
8 Molekularbiologische und genetische Methoden

[Bearbeiten] Untersuchungsmaterial und Materialgewinnung

Shave-Biospie
Stanzbiopsie
Exzisionsbiopsie
Feinnadelbiopsie (FNA)
Schnellschnitt
Resektat

Markierung des Resektats mit Fäden (Operateur) zur Nachvollziehbarkeit der räumlichen Orientierung, falls evtl. nachreseziert werden muss.

[Bearbeiten] Materialtransport

[Bearbeiten] Nativmaterial (NM)

Natives (unbehandeltes) Gewebe wird benötigt für die Schnellschnittdiagnostik (Anfertigung von Gefrierschnitten) und für Fluoreszenzfärbungen (IFA), PCR, für die mikrobiologische Diagnostik (IFT, PCR, Kultur) und den Nachweis enzymatischer Reaktionen.

Nativmaterial ist nicht haltbar, trocknet leicht aus (evtl. Transport auf NaCl) und muss daher so rasch wie möglich weiterverarbeitet werden, evtl. gekühlter Transport.

[Bearbeiten] Formalin-fixiertes Material (FFM)

Formalin-fixiertes Material ist die Grundlage für die konventionelle histologische Untersuchung inklusive Immunhistochemie. Hierzu wird das Gewebe unmittelbar in gepufferte 4 bis 10 %ige Formalinlösung verbracht, um es zu fixieren und damit vor Zersetzung und Austrocknung zu schützen. Die notwendige Dauer der Fixierung ist abhängig von der Dicke und Konsistenz des Gewebes und beträgt i.d.R. etwa 24 h (Eindringtiefe etwa 1 mm pro Stunde). Hohlorgane (z.B. Darm, Harnblase) sollten nach Möglichkeit vor Fixation eröffnet werden, um eine ausreichende Fixation auch der inneren Präparateanteile zu gewährleisten.

[Bearbeiten] Zytologie

Flüssigkeiten, Punktate, Liquor, Sputum
Abstriche, Ausstriche

[Bearbeiten] Begleitformular

Klinische Angaben sind unbedingt notwendig, um eine zuverlässige Diagnostik zu gewährleisten. Dazu gehören z.B.:

Organ (incl. Seitenangaben, Z.n. Vorbiopsien, Z.n. Voroperationen)
Vorbefunde
Verdachtsdiagnosen
Therapien (z.B. Anti-Androgene-Therapie bei Prostatakarzinom, Z.n. neoadjuvanter Chemotherapie)
Bei gynäko-pathologischen Präparaten Angaben zum Zyklus bzw. Menopause
Evtl. klinische Symptomatik, Familienanamnese u.a.

[Bearbeiten] Materialaufbereitung

Gefrierschnitttechnik (Kryostat) für die Schnellschnittdiagnostik oder Enzymtests (Nativmaterial)
Paraffineinbettung
Ggf. Vorbehandlungen:
- Knochen und verkalktes Gewebe muss vor der weiteren Aufarbeitung entkalkt werden, z.B. mit Säuren oder EDTA-Lösung. Letzteres ist schonender und zumindest dann notwendig, wenn am Material noch immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt werden sollen.

[Bearbeiten] Zuschnitt und makroskopischer Befund

Schnittrandkontrolle
- Peripherie-Methode
- Lamellieren (Brotleibtechnik)

Die Schnittränder werden vom zuschneidenden Pathologen ggf. mit Tusche markiert, um diese im Präparat auffinden zu können. Dies ist notwendig um zu beurteilen, wie nahe z.B. ein Tumor an den Schnittrand heranreicht und ob die Resektion in sano (im Gesunden) erfolgt ist.

Der Untersucher erhebt den makroskopischen Befund und beschreibt z.B. Größe, Gewicht, Farbe, Form, Konsistenz und Topologie des Gewebes. Dies ist in Zusammenschau mit der Histologie ein wesentliches Element vieler Diagnosen.

[Bearbeiten] Einbettung

FFM wird entwässert (Alkoholreihe, dann Xylol) und dann in Paraffin eingegossen.

[Bearbeiten] Schnittanfertigung

Vom fertigen Paraffinblock werden mit dem Mikrotom 2-4 μm dünne Schichten geschnitten, in ein warmes Wasserbad verbracht und dort auf die vorher beschrifteten Objektträger aufgezogen. Anschließend werden die Paraffinschnitte (PS) im Wärmeschrank bei 37 °C getrocknet.

In diesem Automaten werden die Präparate entwässert und mit Paraffin behandelt.

Vorbereitung des Gewebes zum Einbetten.

Fertige Paraffinblöcke.

An dieser Station werden mit dem Mikrotom vom Paraffinblock Schnitte angefertigt und auf Objektträger aufgezogen.

Elektrisches Mikrotom mit Paraffinblöcken.

Ein etwas älteres Modell.

Anfertigung von Schnitten.

Das Aufziehen der hauchdünnen Schnitte.

Gefärbt wird per Hand oder vom Automaten.

Fertige Präparate.

[Bearbeiten] Histochemie (Färbungen)

Ungefärbtes Gewebe stellt sich mikroskopisch weitgehend transparent dar. Eine Beurteilung der Morphologie ist hier nicht möglich. Daher müssen Präparate gefärbt werden. Da die verschiedenen Färbechemikalien mit den Gewebe-, Faser- und Zellbestandteilen in unterschiedlicher Weise reagieren, lassen sich aus der Histochemie auch Aussagen über die biochemische Zusammensetzung des Präparates ableiten bzw. es lassen gezielt bestimmte Strukturen anfärben. Beispielsweise bindet das basische Hämatoxylin an saure und damit basophile Zellbestandteile (Zellkern (DNA), geringer Zytoplasma (RNA)), das saure Eosin bindet an azidophile Zellbestandteile (Zytoplasma). Eine erhöhte Basophilie von Zellkern (Hyperchromasie) und/oder Zytoplasma weist daher auf einen gesteigerten Nukleinsäure-Stoffwechsel hin.

Hämatoxylin-Eosin (H&E) - Standardübersichtsfärbung. Zellkerne, Kalk blau. Kollagen, Muskeln, Nerven rot.
Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS) - Färbung von Kohlenhydraten (Glycoproteine, Mucine, Fibrin, Basalmembran) inklusive Pilzen (Zellmembran), purpurrot.
Giemsa - Differentialfärbung, Lymphomdiagnostik, Bakterien.
Elastica-van-Gieson (EvG) - Färbung von kollagenen Fasern (Bindegewebe) rot, elastische Fasern färben sich schwarz-braun.
Masson-Goldner - Kollagen (Bindegewebe) grün, Erythrozyten kräftig rot.
Berliner Blau - Färbung von Eisen, z.B. in Siderophagen, blau.
Grocott-Methenamin-Silber-Färbung - Pilzfärbung (Pilze dunkel vor grünem Hintergrund).
Kongorot - Darstellung von Amyloid (rot).
Alcianblau - Muzin blau
Papanicolaou (PAP) - Färbung für Exfoliativ- und andere Zytologien, z.B. Zervixabstrich.
Perjodsäure-Schiff-Methenamin-Silber (PAM)
Gram - Bakterien.

Fragestellung	Geeignete Färbungen
Pilze	PAS, Grocott
Bindegewebe (Fibrose, Narben,...)	EvG, Masson-Goldner, Ladewig

[Bearbeiten] Immunhistochemie (IHC)

Mit der Immunhistochemie können spezifisch bestimmte Zellproteine sichtbar gemacht werden. Damit lassen sich Zellen bestimmten Zellpopulationen zuordnen oder die Verteilung innerhalb der Zelle oder in einem Gewebe kann beurteilt werden.

Methode: Antigene werden mit einem spezifischen meist monoklonalen Primärantikörper markiert. Der Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit einem Farbstoff-markierten bzw. Enzym-gekoppelten Sekundärantikörper sichtbar gemacht.

Material: Die Immunhistochemie erfolgt überwiegend am Paraffinschnitt. Bestimmte Lymphommarker sind jedoch nur am Nativmaterial möglich (Lymphomdiagnostik!)

Bedeutung der Immunhistochemie:

Pathologische Differentialdiagnostik insb. bei Tumoren (Bsp.: DD Adenokarzinom der Lunge vs. Pleuramesotheliom, Lymphom-Klassifikation)
Aussagen über die Prognose (Bsp.: Mammakarzinome mit einer Her2neu-Überexpression haben eine schlechtere Prognose)
Identifikation von Zielstrukturen für eine spezifische Therapie (Bsp. CD20-exprimierende Lymphome, Östrogen- und Progesteronrezeptor-positive Mammakarzinome)

[Bearbeiten] Antigen-Tabelle geordnet nach Gewebe

[Bearbeiten] Proliferationsmarker

Ki-67 (MIB-1)

[Bearbeiten] Epithel

AE1/3 - Panzytokeratin (Epithel, Mesothel)
Epithelial Membrane Antigen (EMA)
Zytokeratinfraktionen (CK), ca. 20 verschiedene
- CK5/6 - Plattenepithel(karzinom), Mesothel
- CK7 - Drüsenepithel, Adenokarzinom von Lunge, Brust
- CK18 - Drüsenepithel, Adenokarzinom
- CK20 - Adenokarzinom des Colons

[Bearbeiten] Neuroepithel

Neuroendokrine Zellen, Karzinoid/APUDom/Neuroendokrines Karzinom/Kleinzeller-Spektrum:

Chromogranin A
Neuronen spezifische Enolase (NSE)
Synaptophysin
CD56 (NCAM)

Nervengewebe:

S-100 - Neuronales Gewebe, Melanom
Neurofilamentprotein (NFP) - Axonfärbung
GFAP (Glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein) - Gliales zytoplasmatisches Intermediärfilament (Astrozyten, weniger Oligodendrozyten), findet sich v.a. subplasmalemmal und in den Zellfortsätzen.

Primitive neuroektodermale Tumoren (PNET)/Ewing-Sarkom:

CD99
NSE
Vimentin

[Bearbeiten] Melanozyten

S-100 - Neuronales Gewebe, Melanozyten, Melanom
HMB-45
Melan A
Tyrosinase

[Bearbeiten] Schilddrüse

Thyreoglobulin
TTF-1 (thyroid transcription factor 1) - Schilddrüse, Lunge

[Bearbeiten] Plazenta

Humanes Chorion-Gonadotrophin (HCG)

[Bearbeiten] Ovar

CA-125

[Bearbeiten] Mamma

Hormonrezeptoren: Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor
Wachstumsfaktorrezeptoren: Her2neu / c-erbB-2
Cadherin E: DCIS +, LCIS -

[Bearbeiten] Prostata

Sekretorische Zellen: PSA, CK 7, 8, 18, 19, Androgenrezeptor
Prostata-Basalzellen: 34ßE12, Östrogenrezeptoren, Progesteronrezeptoren
Einzelne neuroendokrine Zellen: Chromogranin A
Saure Phosphatase

[Bearbeiten] Mesenchym

Vimentin
Aktin
Desmin
CD 34

Muskel:

Glatter Muskel - Smooth Muscle Actin
Glatter und quergestreifter Muskel - Desmin

GIST: CD 34, CD 117

[Bearbeiten] Endothel

Blutgefäße:

Von Willebrand Faktor (vWF)
CD 31
CD 34

Lymphgefäße:

D2-40

[Bearbeiten] Blut/Knochenmark

CD 34 - Hämatopoetische Stammzelle und Vorläuferzellen, kapilläres Endothel, GIST
- Myeloische Zellinie:
  - Myeloische Vorstufen:
    - CD 13 - Myelomonozytische Zellen
    - CD 33 - Myeloide Vorläuferzellen, Monozyten
    - CD 41 - Thrombozyten, Megakaryozyten
  - Granulozyten und Vorstufen (Blasten):
    - MPO (Myeloperoxidase)
    - CAE (Chlorazetatesterase) - Granulozyten vom frühen Promyelozyten bis zum reifen Neutrophilen
  - ANAE (alpha-Naphtylacetatesterase) - Monozyten und Megakaryozyten in allen Stadien
  - CD 68 - Monozyten, Makrophagen (evtl. auch Granulozyten-Vorläufer, Mastzellen)
  - LANGHANS-Zellen - S-100, CD 1a
- Lymphozytenlinie:
  - T-Zelle:
    - CD 3 - Pan-T-Lymphozytenmarker
    - CD 4 - T-Helferzellen
    - CD 5
    - CD 8 - Zytotoxische T-Zellen
    - CD 15 - Neutrophile, Eosinophile, Monozyten, Reed-Sternberg-Zellen
    - CD 30 - Ki-1 Antigen (u.a. CD 30 + CTCL)
    - CD 45 RA - Naive T-Lymphozyten
    - CD 45 RO - Memory-T-Lymphozyten
    - CD 56 - NK-Zellen
  - B-Zelle:
    - CD 10 - Mittlere Reifestadien der B-Lymphozyten
    - CD 19 - Pan-B-Lymphozytenmarker (außer Plasmazellen)
    - CD 20 - B-Zellen
    - CD 23 - B-Lymphozyten, dendritische Zellen
    - CD 79a

[Bearbeiten] Lunge/Pleura

Kleinzelliges Bronchialkarzinom der Lunge:

Chromogranin A (evtl. -)
Neuronen spezifische Enolase (NSE) (evtl. -)
Synaptophysin (evtl. -)

Plattenepithelkarzinom der Lunge:

AE1/3 - Panzytokeratin (Epithel, Mesothel)
CK5/6 - Plattenepithel(karzinom), Mesothel

Adenokarzinom der Lunge:

CEA
TTF-1 - Adenokarzinom der Lunge, Schilddrüsenkarzinome
CK7

Pleuramesotheliom:

AE1/3 - Panzytokeratin (Epithel, Mesothel)
D2-40
Calretinin

[Bearbeiten] Magen-Darm-Trakt

CDX2

[Bearbeiten] Antigen-Tabelle geordnet nach Marker

AE1/AE3 bzw. AE1/3 - Panzytokeratin (Epithel, Mesothel)
α-Fetoprotein - HCC, Dottersacktumor
Cadherin E - DCIS +, LCIS -
Calbindin - Zerebelläre Purkinje-Zellen
Calretinin - Pleuramesotheliom
CD 31 - Endothelien
CD 34 - Hämatopoetische Vorläufer, Weichteiltumoren, Kapillarendothel, GIST
CDX2 - Magen-Darm-Trakt
CEA (Carcinoembryonales Antigen) - Embryonales Gewebe, verschiedene Karzinome
D2-40 - Lymphendothel, Pleuramesotheliom
GFAP (Glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein) - Gliales zytoplasmatisches Intermediärfilament (Astrozyten, weniger Oligodendrozyten), findet sich v.a. subplasmalemmal und in den Zellfortsätzen
HMB45 - Melanom, Angiomyolipom
Neurofilamentprotein (NFP) - Axonfärbung
S-100 - Glia, Ependymzellen, Melanozyten, häufig auch Speicheldrüsentumoren
TTF-1 (Thyroid Transcription Factor 1) - Adenokarzinom der Lunge, Schilddrüsenkarzinome

[Bearbeiten] Antigene mit therapeutischer Relevanz

Antigen	Erkrankungen	Therapeutischer Ansatz/Implikaqtion
Östrogenrezeptor	Mammakarzinom	Östrogenrezeptorantagonisten/-modulatoren (z.B. Tamoxifen)
Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu)	Mammakarzinom mit HER2/neu-Überexpression	Monoklonale Antikörper (MAB) gegen HER2/neu (z.B. Trastuzumab)
Epidermal growth factor receptor (EGFR)	verschiedene EGFR-exprimierende Tumoren	Monoklonale Antikörper gegen EGFR (z.B. Cetuximab, Panitumumab). Tyrosinkinasehemmer (z.B. Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib).
CD20	B-Zell-Lymphome	Rituximab
CD117 (c-kit)	CML, GIST u.a.	Tyrosinkinasehemmer (z.B. Imatinib)
ERCC1		Die Expression des DNA-Reparaturgens im Tumorgewebe deutet auf ein verschlechtertes Ansprechen auf eine Therapie mit Platin-Verbindungen hin

Weblinks:

[Bearbeiten] Elektronenmikroskopie (EM)

Die EM ist eine wichtige Spezialuntersuchung für Fragestellungen, bei denen die Ultrastruktur des Präparats entscheidend zur Diagnose beitragen kann. Mögliche Anwendungen sind z.B.:

Glomerulonephritiden - Diagnose (Minimal-change-GN, ALPORT-Syndrom) und Diagnosesicherung
Kardiomyopathien, Mitochondriopathien, Speicherkrankheiten
Zilienerkrankungen (KARTAGENER-Syndrom bzw. primäre ziliäre Dyskinesie).
Schnelldiagnostik von viralen Erkrankungen (Bestimmung der morphologisch definierten Virusfamilie)

[Bearbeiten] Immunfluoreszenz-Techniken (IF)

Immunfluoreszenz-Techniken arbeiten ebenfalls mit Antikörpern und dienen ebenfalls zur Darstellung von Antigenen.

Fluoreszenzmikroskop.

[Bearbeiten] Direkte Immunfluoreszenz (DIF)

Bei der DIF werden Antigene mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper markiert. Diese können dann in einem speziellen Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Material: Nativ-Material

[Bearbeiten] Molekularbiologische und genetische Methoden

Nachweis spezifischer DNA (Erreger wie Tbc oder HPV, Translokationen in Tumoren). Aufwändig, i.d.R. in Referenzzentren durchgeführt.

Material: Je nach Fragstellung ist natives oder formalinfixiertes Material besser geeignet.

nativ: besser für die DNA-Isolierung (PCR)
formalinfixiert: kann für die RNA-Isolierung (RT-PCR) günstiger sein, da Formalin auch die RNAasen inaktiviert.

Beispiel: Nachweis von aktivierenden KRAS-Mutationen. KRAS ist in den EGF-Rezeptor-Weg eingeschaltet. Verschiedene Tumorerkrankungen sprechen auf eine Therapie mit therapeutischen Antikörpern gegen EGFR (Cetuximab, Panitumumab) an, aber nur wenn der KRAS-Wildtyp vorliegt. Methode: PCR, dann Sequenzierung. Anwendung z.B. beim metastasierenden Kolonkarzinom.