Pilzzucht/ Zucht mit Petrischalen
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[Bearbeiten] Herstellung von Nährböden / Arbeiten mit Agar
[Bearbeiten] Was ist Agar?
Agar ist ein Polysaccharid, das in den Zellwänden einiger roter Algen vorkommt. Dieses wird durch Kochen aus den Zellen extrahiert und anschließend gereinigt. Wenn Agar in kochendem Wasser aufgelöst wird und abkühlt, bildet es ein Gel (ähnlich wie Gelatine). Agar wird in vielen Bereichen der Lebensmittelindustrie eingesetzt, z.B als veganes Geliermittel. Hauptverwendungszweck ist aber als Nährboden in der Mikrobiologie. Kaufen kann man es z.B. in asiatischen Lebensmittelläden.
[Bearbeiten] Warum ist Agar so wichtig?
Wir benutzen Agar als Trägermaterial für Nährstoffe. Die Nährstoffe (Agar selbst enthält keine verwertbaren Nährstoffe) bilden zusammen mit dem Agar eine flache, zweidimensionale Kultivierungsebene worauf das Pilzmyzelium wächst. Agar kann nicht durch Gelatine ersetzt werden, da Gelatine verdaulich ist und nicht geliert nachdem es sterilisiert wurde.
[Bearbeiten] Agar-Rezepte für die Praxis!
So wie es verschiedene Pilzarten gibt, gibt es auch verschiedene Rezepte für Nährböden. Hier einige Rezepte (100 ml reichen für bis zu zehn Petrischalen):
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[Bearbeiten] Nährboden sterilisieren
Hat man sich nun für einen Agar-Nährboden entschieden und diesen vorbereitet, kann er in die Petrischalen verfüllt und anschließend im Dampfdruckkochtopf oder Autoklaven sterilisiert werden. Dazu werden die Petrischalen mit etwa zwei bis sechs mm Agar-Medium gefüllt. Man sollte darauf achten dabei nicht zu kleckern oder zu spritzen, da am Rand der Schale herunterlaufender Agar später zu einer idealen Brücke für Kontaminationen wird. Lässt man den Agar nach dem Befüllen der Petrischalen abkühlen und fest werden, wird die Wahrscheinlichkeit etwas beim Transport in den Dampfdruckkochtopf zu verschütten verringert.
Die Petrischalen sollten nun für etwa 35 Minuten im Dampfdruckkochtopf / Autoklaven sterilisiert werden. Die Zeit zählt dabei ab dem Zeitpunkt an dem der Topf die Temperatur erreicht hat, also erst dann wenn das Überdruckventil zu pfeifen beginnt.
[Bearbeiten] Beimpfen der Petrischalen mit Sporen
Im Normalfall werden zum Beimpfen der Petrischalen Sporen von einem Sporenabdruck genommen. Es ist aber auch möglich die Sporen aus dem Hut eines getrockneten Pilzes zu verwenden. In beiden Fällen werden dabei die Sporen mit einer Präpariernadel vom Sporenträger in die vorbereiteten Petrischalen übertragen. Hierzu wird die Präpariernadel in einer Flamme erhitzt und somit sterilisiert. Zum Erhitzen kann ein Spiritusbrenner oder einfach ein Feuerzeug verwendet werden; der Vorteil des Spiritus ist, dass die Präpariernadel nicht verrußt. Wird mit einer Impfbox gearbeitet so muss das Werkzeug außerhalb der Box ausgeglüht werden, um allfällig angesammelte brennbare, eventuell auch explosive Dämpfe des Desinfektionsmittels in der Impfbox nicht zu entzünden.
[Bearbeiten] Übertragen der Sporen
Ist die Nadel erhitzt wird sie im Agar der zu beimpfenden Petrischale abgekühlt, somit werden die Sporen bei der Berührung nicht abgetötet und haften durch den feuchten Agar gleich gut an der Nadel. Die Sporen werden nun im Agar abgestreift. Wichtig dabei ist, dass die Zeit, in der die Schale geöffnet wird immer möglichst kurz gehalten wird.
[Bearbeiten] Sauberkeit
Beim Arbeiten mit Petrischalen ist absolute Sauberkeit oberstes Gebot, d.h. der Arbeitsplatz sollte zu Beginn gut desinfiziert werden und die Umgebungsluft sollte auch möglichst wenig Fremdsporen oder Keime enthalten. Zur Desinfektion eignen sich Sprühdesinfektionsmittel wie z.B. Sagrotan oder Meliseptol. Um die Umgebungsluft keimfrei zu machen empfiehlt sich die Anschaffung eines HEPA-Filters beziehungsweise Luftreiniger oder der Bau einer Impfbox.
Beim unsauberen Arbeiten entwickeln sich schnell unerwünschte Organismen.
[Bearbeiten] Petrischalen versiegeln
Nach der Arbeit mit Petrischalen (impfen/klonen) müssen diese gegen Kontaminanten (Sporen/Bakterien) aus der umgebenden Luft geschützt werden. Dies geschieht am einfachsten mit Polyethylen-Frischhaltefolie (PE-Folie). PE-Folienrollen aus der Haushaltsabteilung können mit einem Scharfen Messer in fünf cm breite Stücke geschnitten werden und eignen sich bestens zum Umwickeln der Petrischalen. Etwa fünf Lagen (lieber eine Lage zuviel als eine zuwenig) stramm um die geschlossene Petrischale wickeln, sodass der Spalt zwischen Schale und Deckel komplett bedeckt und geschützt ist. So versiegelt kann die Petrischale ohne Sorgen transportiert oder eingelagert werden. Die Profis benutzen zur Versiegelung Parafilm, da dieser einen optimalen Luftaustausch ermöglicht und gleichzeitig vor Kontaminationen schützt.
[Bearbeiten] Stamm selektieren
Für homogene Ergebnisse sollte man nun einen reinen Stamm selektieren, der sich durch starken rhizomorphen Wuchs auszeichnet. Mit nur einem Stamm zu arbeiten hat den Vorteil, dass später das komplette Substrat durchwachsen und genutzt wird: Bei mehreren Stämmen könnten Stellen im Substrat von Myzel durchwachsen worden sein das nie die Gelegenheit bekommt zu fruchten.
[Bearbeiten] Beimpfen der Petrischalen mit Myzel
Hat man aus Sporen Myzel gewonnen und will dieses vermehren oder möchte man Myzel von einer kontaminierten Petrischale isolieren, wird Myzel von einer zur anderen Petrischale übertragen. Dazu wird mit einer Präpariernadel oder einem Skalpell ein Stück Myzel aus einer Petrischale herausgeschnitten und in der anderen Schale abgelegt. Das Myzelstück sollte möglichst mittig plaziert werden, da das Wachstum kreisförmig (radial) verläuft. Auch hier ist sauberes Arbeiten wieder sehr wichtig. Optional kann hier mit Wasserstoffperoxid gearbeitet werden, um das Myzelstück von frischen Schimmelsporen und Bakterien aus der Luft zu reinigen. Dazu legt man das Myzel für z.B. 30 Sekunden in eine dreiprozentige Lösung. Wasserstoffperoxid greift Schimmelsporen und Bakterien an und zerstört sie durch Oxidation, Myzel kann sich jedoch zeitweise schützen.
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[Bearbeiten] Klonen
Das Klonen von Pilzen ist eine gute Methode um Myzel zu gewinnen.
Wenn man im Besitz eines guten gesunden Pilzes ist, ist es leichter ihn zu klonen als über einen Sporenabdruck aufwändig Myzel zu isolieren. Mit dem Klonen kann man billig an schnellwüchsige und kräftige Stämme kommen in dem man einfach die gewünschten Pilze im Supermarkt erwirbt oder sie beim Sammeln erntet.
Zum Klonen selbst werden Petrischalen vorbereitet und mit einem kleinen Stück aus dem Inneren des Pilzes beimpft. Früher sagte man, dass der Pilz dazu mit einem sterilen Messer oder Skalpell zerschnitten werden soll, es hat sich aber erwiesen dass es einfacher ist den Pilz in der Mitte zu zerreißen. Hat man ihn geteilt, schneidet oder kratzt man mit einem sterilisierten Skalpell oder Präpariernadel ein kleines Stück Pilz aus dem Inneren heraus und gibt es auf den Agar. Man sollte darauf achten, dass man nicht mit dem Äußeren des Pilzes in Berührung kommt, da an der Oberfläche Fremdsporen oder Keime anhaften können.
[Bearbeiten] Petris im Kühlschrank einlagern
Pilzgenetik in einer Petrischale kann man gut über mehrere Monate aufbewahren, indem man die versiegelte Petrischale im Kühlschrank bei zwei bis vier °C einlagert. Da die meisten Pilze ihr Wachstum und ihren Stoffwechsel bei so geringen Temperaturen auf ein Minimum reduzieren, können sie so bis zu 18 Monaten unbeschadet überstehen. Falls Außenstehende Bedenken haben sollten, so seien sie beruhigt: Der Pilz kann die Petrischale nicht verlassen und auch keine Sporen abgeben.
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