Pilzanbau/ Anbau mit Petrischalen

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Arbeitsmethoden[Bearbeiten]

Warum Sterilisation?[Bearbeiten]

Um gezielt mit definierten Mikroorganismen wie Pilzen arbeiten zu können, muss sichergestellt werden, dass keine unerwünschten Keime wie Hefen oder Schimmelsporen im Substrat enthalten sind. Andernfalls wird das bereitgestellte Nährmedium von den schneller wachsenden Kontaminanten besiedelt, bevor es der Pilz kann. Manche Mikroorganismen produzieren gesundheitsschädliche Aflatoxine, die in die Umgebung abgesondert werden. Neben pathogenen Mikroorganismen bilden auch Speisepilze wie das Stockschwämmchen Sporen aus, die nach intensivem Einatmen zu einer allergischen Reaktion führen können.

Zur Keimreduzierung gibt es verschiedene Sterilisationsverfahren. Hitzestabile Substrate werden gewöhnlich unter Dampf mit Überdruck von 2 bar bei 121° C autoklaviert. Dazu kann ein Autoklav oder Schnellkochtopf genutzt werden. Feuchte- und druckempfindliche Stoffe und Geräte können bei höheren Temperaturen und längerer Sterilisationsdauer in Öfen trocken sterilisiert werden (z.B. 4 Stunden bei 160° C). Sterilfilter mit Porengrößen von 0,2 µm Durchmesser kommen zum Einsatz, wenn Lösungen mit hitzelabilen Bestandteilen steril filtriert werden müssen. Hitzeempfindliche Gegenstände können chemisch zum Beispiel unter Einsatz starker Säuren und Laugen oder durch ionisierende Gammastrahlung sterilisiert werden.

Neben vegetativen Zellen unerwünschter Mikroorganismen werden bei der thermischen Sterilisation auch deren Dauerformen abgetötet. Dabei dauert die Reduktion lebensfähiger Sporen jeweils eine Zehnerpotenz bei 121 °C etwa eine Minute. Bei thermischen Sterilisationsverfahren muss eingeplant werden, dass ein größeres Volumen an Substrat eine längere Sterilisationsdauer benötigt, um die erforderliche Kerntemperatur zu erreichen.

Herstellung von Nährböden / Arbeiten mit Agar[Bearbeiten]

Agarplatte als Nährboden für Pilze.

Kultivierung[Bearbeiten]

Zur Zucht von Mikroorganismen werden im Labor flüssige oder durch Agar verfestigte Kulturmedien genutzt, welche die vom jeweiligen Organismus zum Wachstum benötigten Substanzen bereitstellen. Je nach Ziel der Kultivierung werden verschiedene Reaktionsgefäße genutzt. Aus Kosten- und Nutzengründen sind Petrischalen gut zur Pilzzucht geeignet. Für den privaten Gebrauch werden Petrischalen aus Glas (wiederverwendbar, ca. 3 € / Stk. z.B. über Apotheke), steril verpackte Petrischalen aus PE-Kunststoff (ca. 0,20 € / Stk.) und mit fertig sterilisiertem Nährmedium befüllte Kunststoff-Petrischalen (ca. 1,70 € / Stk.) angeboten.

Was ist Agar?[Bearbeiten]

Agar ist ein Polysaccharid, das in den Zellwänden einiger roter Algen vorkommt. Dieses wird durch Kochen aus den Zellen extrahiert und anschließend gereinigt. Wenn Agar in kochendem Wasser aufgelöst wird und abkühlt, bildet es ein Gel (ähnlich wie Gelatine). Agar wird in vielen Bereichen der Lebensmittelindustrie eingesetzt, z.B als veganes Geliermittel. Hauptverwendungszweck ist aber als Nährboden in der Mikrobiologie. Kaufen kann man es z.B. in asiatischen Lebensmittelläden und Reformhäusern.

Warum Agar?[Bearbeiten]

Wir benutzen Agar als Trägermaterial für Nährstoffe. Die Nährstoffe (Agar selbst enthält keine verwertbaren Nährstoffe) bilden zusammen mit dem Agar eine flache, zweidimensionale Kultivierungsebene worauf das Pilzmyzelium wächst. Agar kann nicht durch Gelatine ersetzt werden, da Gelatine verdaulich ist und nicht geliert, nachdem es sterilisiert wurde.

Agar-Rezepte für die Praxis[Bearbeiten]

Petrischale mit Auster-Myzel (weiß), kontaminiert mit Schimmel (grau) und Bakterien (verteilt)

So wie es verschiedene Pilzarten gibt, gibt es auch verschiedene Rezepte für Nährböden. Hier einige Rezepte (100 ml reichen für bis zu zehn Petrischalen):

Hundefutter-Agar[Bearbeiten]

Hundefutter-Agar

Guter Nährboden für viele Pilzarten dessen Zutaten leicht zu besorgen sind.

  • 30 g Hundetrockenfutter
  • 25 g Agar-Agar
  • 1,1 l Wasser

Die Zutaten werden vermengt, püriert und anschließend einige Minuten gekocht.

Malzextrakt-Agar (MEA)[Bearbeiten]

Bewährter Nährboden, der Kontaminationen schnell erkennen lässt:

  • 20 Gramm helles Malz Extrakt (das dunkle aus dem Reformhaus karamellisiert zwar schneller, zum Keimen aus Sporen lässt es sich jedoch sehr gut verwenden)
  • 25 Gramm Agar
  • 1,1 l warmes Wasser

Zu Malz und Agar wird anschließend das Wasser hinzugegeben und alles einige Minuten gekocht. Dieses Rezept reicht für über 50 Petrischalen.

Kartoffel-Agar[Bearbeiten]

Kartoffelagar

Wurde früher oft verwendet.

  • 1 bis 5 Kartoffeln
  • pro 100ml Sud etwa einen Teelöffel Agar

Die Kartoffeln werden weich gekocht und noch im Wasser nach dem Abkühlen zerstampft, diesen Sud durch ein dünnes Sieb oder Handtuch pressen, auf 100 ml einen Teelöffel Agar lösen und einige Minuten kochen.

Befüllen der Petrischalen mit Nährboden und Sterilisation[Bearbeiten]

Der Nährboden kann vor oder nach einer Dampf-Sterilisation in die Petrischalen überführt werden. Letztere Arbeitsmethode wird in mikrobiologischen Labors genutzt, in denen eine keimfreie Umgebung durch den Einsatz von Luftfiltern oder sterilen Werkbanken garantiert werden kann.

Befüllen der Petrischalen mit Agar[Bearbeiten]

Dazu werden die Petrischalen mit etwa zwei bis sechs mm Agar-Medium gefüllt. Man sollte darauf achten, dabei nicht zu kleckern oder zu spritzen, da am Rand der Schale herunterlaufender Agar später zu einer idealen Brücke für Kontaminationen wird. Lässt man den Agar nach dem Befüllen der Petrischalen abkühlen und fest werden, wird die Wahrscheinlichkeit, etwas beim Transport in den Dampfdruckkochtopf zu verschütten, verringert.

Werden Petrischalen erst nach der Sterilisation gegossen, kann das noch warme Nährmedium nach Entnahme aus dem Autoklaven / Dampfdruckkochtopf im Wasserbad bei 55 °C zwischengelagert werden. In keimfreier Umgebung (etwa vor einem Schwebstofffilter, auch HEPA genannt) wird das Sterilisationsgefäß geöffnet und der Glasrand kurz abgeflammt. Beim Turmguss-Verfahren werden sterile Petrischalen übereinander zu einem Turm gestapelt und beginnend mit der untersten Petrischale gegossen. Dabei wird der gesamte Turm an Petrischalen zusammen mit dem Deckel der untersten Schale wenige Zentimeter angehoben, befüllt und auf gleiche Weise mit der nächsten Schale fortgefahren. Aufgrund des noch warmen Nährmediums in der darüberliegenden Petrischale wird Kondenswasserbildung stark reduziert.

Kondenswasser in Petrischalen[Bearbeiten]

Gelegentlich sammelt sich nach der Sterilisation Kondenswasser auf dem Nährboden. Um das Besiedeln des Nährbodens zu erleichtern, sollten die Petrischalen auf dem Kopf gelagert werden, damit sich angefallenes Kondenswasser im Deckel sammelt. Kondensation kann vermieden werden, indem man nach dem Gießen des Agars die Petrischalen erst vollständig abkühlen lässt, bevor man den Deckel auf die Schalen legt. Mit längerer Expositionszeit steigt jedoch die Kontaminationsgefahr. Alternativ kann man den beschlagenen Deckel - nach dem Abkühlen - durch einen zweiten, sterilen Deckel austauschen und somit die Expositionszeit minimieren und dennoch das Kondenswasser entfernen.

Sterilisation der Petrischalen[Bearbeiten]

Das Nährmedium sollte für mindestens 20 Minuten im Dampfdruckkochtopf / Autoklaven sterilisiert werden. Die Zeit zählt dabei ab dem Erreichen der Sterilisationstemperatur im Innern des Kulturmediums und frühestens erst dann, wenn das Überdruckventil zu pfeifen beginnt.

Beim Abkühlen ist zu beachten, dass der Topf langsam abgekühlt wird, und der Druck nicht abgelassen wird. Andernfalls kann es zum Siedeverzug kommen. Bereits in Petrischalen gegossenes Medium kocht über und verunreinigt die Kulturgefäße äußerlich, sodass ein keimfreies Arbeiten nicht mehr möglich ist.

Beimpfen der Petrischalen mit Sporen[Bearbeiten]

Sporenkeimung auf Kartoffel-Agar, etwa sieben Tage alt

Im Normalfall werden zum Beimpfen der Petrischalen Sporen von einem Sporenabdruck genommen. Es ist aber auch möglich, die Sporen direkt aus dem Hut eines getrockneten Pilzes zu verwenden. In beiden Fällen werden dabei die Sporen mit einer Präpariernadel vom Sporenträger in die vorbereiteten Petrischalen übertragen. Hierzu wird die Präpariernadel in einer Flamme erhitzt und somit sterilisiert. Zum Erhitzen kann ein Spiritusbrenner oder einfach ein Feuerzeug verwendet werden. Der Vorteil des Spiritus ist, dass die Präpariernadel nicht verrußt. Wird in einer Impfbox gearbeitet, so muss das Werkzeug außerhalb der Box ausgeglüht werden, um etwaig angesammelte brennbare, eventuell auch explosive Dämpfe des Desinfektionsmittels in der Impfbox nicht zu entzünden.

Übertragen der Sporen[Bearbeiten]

Ist die Nadel erhitzt, wird sie im Agar der zu beimpfenden Petrischale abgekühlt. Somit werden Sporen bei der Berührung nicht abgetötet und haften durch den feuchten Agar gut an der Nadel. Die Sporen werden nun im Agar abgestreift. Wichtig ist, dass schnell gearbeitet wird, um die Expositionszeit des Kulturmediums mit etwaig kontaminierter Umgebungsluft gering zu halten. Um Luftverwirbelungen mit Kontaminationen zu vermeiden, sollten keine hektischen Bewegungen ausgeführt werden. Durch Tröpfcheninfektion beim Sprechen können Keime aus der Mundhöhle in einem Bereich von 2 Metern verteilt werden, weshalb ein Mundschutz vorteilhaft sein kann.

Sauberkeit[Bearbeiten]

Beim Arbeiten mit Petrischalen ist eine saubere Arbeitsweise oberstes Gebot. Zu Beginn sollte der Arbeitsplatz gründlich mit Flächendesinfektionsmittel (Meliseptol, Sagrotan) gereinigt werden und die Umgebungsluft sollte keine Fremdsporen oder Keime enthalten. Zur Keimreduzierung der Umgebungsluft empfiehlt sich die Anschaffung eines Schwebstofffilters (HEPA-Filter) oder der Bau einer Impfbox.

Stamm selektieren[Bearbeiten]

Verschiedene Pilzstämme in Petrischalen

Wenn mit Sporen gearbeitet wird, so entsteht bei der Keimung immer ein neuer Stamm, selbst wenn die Sporen alle von einem Fruchtkörper abstammen. Dazu müssen zwei genetisch unterschiedliche Sporen keimen und schließlich zusammenwachsen. Da bei der Impfung etliche Sporen übertragen werden, ist davon auszugehen dass auch mehrere neue Stämme entstehen. Diese Stämme sind aber meist nicht kompatibel, können nicht miteinander verwachsen und kämpfen daher um Nährstoffe. An der Stelle an der die Stämme aufeinander treffen stirbt das Myzel ab und/oder bildet eine Art Schutzschicht aus verstärkten Hyphen gegen den anderen Stamm.

Für homogene Ergebnisse sollte man nun einen reinen Stamm selektieren, der sich durch starken rhizomorphen Wuchs auszeichnet. Rhizomorphes Myzel erinnert in der Erscheinung an die Wurzeln von Pflanzen und ist weniger stark verzweigt als flauschiges Myzel - welches im Allgemeinen zu Ertragsdepressionen führt oder eine Fruchtung ganz verhindert (auch bekannt als "schwimmendes" Myzel). Mit nur einem Stamm zu arbeiten hat den Vorteil, dass später das komplette Substrat von nur einem Stamm durchwachsen und genutzt wird.

Man entnimmt daher, in steriler Umgebung, einen Teil des rhizomorphen Myzel aus der Petrischale und impft damit ein neues Nährmedium (siehe entsprechendes Kapitel). Dies wiederholt man solange bis in der Petrischale nur noch ein gleichmäßiger rhizomorpher Wuchs ohne "Sektoren" zu erkennen ist.

Es sei noch angemerkt dass nicht jeder Stamm der ein schönes rhizomorphes und gleichmäßiges Wachstum zeigt auch zwingend fruchtungsfähig ist (für weitere Informationen lese man das Kapitel "Biologische Grundlagen" mir Augenmerk auf die Begriffe Monokaryon bzw. unfruchtbare Stämme). Es empfiehlt sich daher u. U. das durchwachsene Medium durch Licht, Temperatur und Luftfeuchte zu stimulieren und die Fruchtungsfähigkeit zu verifizieren. In der Regel ist dies aber nicht nötig.

Beimpfen der Petrischalen mit Myzel[Bearbeiten]

Hat man aus Sporen Myzel gewonnen und will dieses vermehren, oder möchte man Myzel von einer kontaminierten Petrischale isolieren, wird Myzel von einer zur anderen Petrischale übertragen.

Dazu wird mit einer Präpariernadel oder einem Skalpell ein Stück Myzel aus einer Petrischale herausgeschnitten und in der anderen Schale abgelegt. Das Myzelstück sollte möglichst mittig platziert werden, da das Wachstum kreisförmig (radial) verläuft. Auch hier ist sauberes Arbeiten wieder sehr wichtig. Optional kann hier mit Wasserstoffperoxid gearbeitet werden, um das Myzelstück von frischen Schimmelsporen und Bakterien aus der Luft zu reinigen. Dazu legt man das Myzel für z.B. 30 Sekunden in eine dreiprozentige Lösung. Wasserstoffperoxid greift Schimmelsporen und Bakterien an und zerstört sie durch Oxidation. Das Myzel kann sich jedoch zeitweise schützen.

Klonen[Bearbeiten]

Klonen eines Champignon

Das Klonen von Pilzen ist eine gute Methode, um Myzel zu gewinnen. Myzel kann direkt aus einen gesunden Fruchtkörper entnommen werden, statt es aufwändig aus einem Sporenabdruck zu isolieren. Indem man die gewünschte Pilzart im Supermarkt erwirbt oder sie beim Sammeln erntet und anschließend klont, kann man günstig schnellwüchsige und kräftige Stämme erwerben.

Zum Klonen wird ein Fruchtkörper unter keimfreien Bedingungen der Länge nach auseinander gerissen. Mit einem sterilisierten Skalpell oder einer Präpariernadel wird eine kleine Menge Myzel aus dem Inneren entnommen und auf bzw. in das Kulturmedium überführt. Da Fremdsporen und Keime an der Oberfläche des Fruchtkörpers anhaften können, sollte vorsichtig gearbeitet werden. Zusätzlich kann der Fruchtkörper des Pilzes mit Wasserstoffperoxid-Lösung behandelt werden.

Alternativ lassen sich Pilze auch auf unbehandelter Wellpappe klonen. Hierzu wird ein Stück aus dem inneren des möglichst frischen Pilzes geschnitten und zwischen zwei Wellpappe Schichten gelegt. Dieses "Sandwich" gibt man dann in ein sterilisiertes/pasteurisiertes Glasgefäß. Nach zwei Tagen sollte das Myzel damit beginnen, die Pappe zu durchwachsen. Nach etwa einer Woche ist die Pappe komplett besiedelt. Diese Technik funktioniert mit fast allen Holz und Stroh besiedelnden Arten.

Petrischalen versiegeln[Bearbeiten]

Nach der Arbeit mit Petrischalen (impfen/klonen) müssen diese gegen Kontaminanten (Sporen/Bakterien) aus der umgebenden Luft geschützt werden. Dies geschieht am einfachsten mit Polyethylen-Frischhaltefolie (PE-Folie). PE-Folienrollen aus der Haushaltsabteilung können mit einem Scharfen Messer in fünf Zentimeter breite Stücke geschnitten werden und eignen sich bestens zum Umwickeln der Petrischalen. Etwa fünf Lagen (lieber eine Lage zuviel als eine zuwenig) stramm um die geschlossene Petrischale wickeln, sodass der Spalt zwischen Schale und Deckel komplett bedeckt und geschützt ist. So versiegelt kann die Petrischale ohne Sorgen transportiert oder eingelagert werden. Die Profis benutzen zur Versiegelung Parafilm, da dieser einen optimalen Luftaustausch ermöglicht und gleichzeitig vor Kontaminationen schützt.

Petrischalen im Kühlschrank einlagern[Bearbeiten]

Pilzmyzel in einer Petrischale kann man gut über mehrere Monate aufbewahren, indem man die versiegelte Petrischale im Kühlschrank bei zwei bis vier °C einlagert. Da die meisten Pilze ihr Wachstum und ihren Stoffwechsel bei so geringen Temperaturen auf ein Minimum reduzieren, können sie so bis zu 18 Monaten unbeschadet überstehen. Der Pilz kann die Petrischale nicht verlassen und auch keine Sporen abgeben.


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